La mayor parte de las mutaciones que causan enfermedades hereditarias son tan pequeñas que no pueden identificarse mediante análisis citogenéticos como cariotipos.

Cuando existen deleciones de un segmento de un gen o de un gen completo, como en casos de Distrofia Muscular de Duchenne la deleción se puede identificar mediante:

a) “Southern blot”. Utilizando una sonda (ADN complementario al gen de interés) marcada radiactivamente se observa la ausencia o una disminución en la longitud del segmento de ADN hibridizado.

b) PCR. Utilizando oligonucleótidos iniciadores (sentido y   anti-sentido) que flanquean cada uno de los exones de un gen se detecta ausencia de amplificación para los exones deletados.

Reacción en cadena de la polimerasa

c) FISH.  Utilizando una sonda de ADN fluorescente complementaria al gen de interés se observa ausencia de hibridación en el cromosoma afectado.

Duplicaciones de genes y expansiones de nucleótidos. Cuando existen amplificaciones en el número de copias de un gen, como en el caso del oncogén myc asociado a Neuroblastoma en humanos, se puede detectar generalmente mediante:

a) Southern blot.  Se observa como un fragmento de mayor longitud o de mayor intensidad. También cuando existen rearreglos genéticos en que segmentos alejados de un gen son yuxtapuestos por recombinación, se pueden identificar por “Southern blot” como un fragmento de longitud anormal.

Un tipo de expansión de nucleótidos analizados frecuentemente en clínica son los Microsatélites. Éstos son repeticiones en tándem de secuencias cortas de nucleótidos, generalmente de 2 a 20.  Se encuentran dispersas a lo largo del genoma y algunas en la vecindad de algún gen.  Aunque su función no se conoce son marcadores útiles de Polimorfismo y segregación cromosomal.  Es decir, es posible asociar una mutación en un individuo directamente al cromosoma del padre o al de la madre. Estos Microsatélites pueden expandirse o deletarse y este suceso puede asociarse a alteraciones cromosomales que llevan al Cáncer; proceso que se conoce como Pérdida de Heterozigocidad (“LOH”).

Para detección de mutaciones puntuales comunes conocidas, como por ejemplo en las enfermedades Anemia de Células Falciformes, algunos tipos de Talasemias, de Fibrosis Quística, Fenilcetonuria y Gaucher entre pocas otras, se pueden utilizar las siguientes aplicaciones de PCR:

a) Hibridación con Oligonucleótido Específico de Alelo (ASO). En este método se aísla ADN genómico del paciente y se hace PCR con oligonucleótidos iniciadores cercanos al sitio de la mutación. El producto de PCR se hibridiza con un oligonucleótido 100% complementario a la secuencia silvestre (normal) y con otro oligonucleótido 100% complementario a la secuencia mutada.  Este formato se utiliza con frecuencia en la tipificación molecular para antígenos de histocompatibilidad mayor (HLA-MHC).

b) PCR Específica de Alelo. Se utiliza un oligonucleótido iniciador, generalmente el Sentido con su último nucleótido del extremo 3 ́ complementario a la secuencia silvestre y otro Oligonucleótido con el extremo 3 ́ complementario a la secuencia mutada; con ambos oligos Sentido se acompañan del mismo oligo Antisentido. Solo   habrá   producto   de   PCR   cuando   el   oligo Sentido   sea complementario a la secuencia blanco.

c)   PCR y Análisis de Enzima de Restricción (PCR-RFLP).  Algunas veces la mutación crea o altera un sitio reconocido por una enzima de restricción específica.  Es el ejemplo de la anemia de células falciformes y en algunos Polimorfismos o variaciones genéticas. En estos casos se aísla ADN genómico y se amplifica mediante PCR la región que contiene el sitio de la mutación y después se incuba con la enzima de restricción específica.  Es muy útil en clínica para tamizar varias muestras cuando se trata de mutaciones muy frecuentes.

Escaneo molecular de mutaciones

Cuando se sospecha que un gen puede estar mutado en cierta enfermedad, pero no se conoce el sitio exacto de la mutación, el primer abordaje es recurrir a alguno de los siguientes métodos para definir la región o área (p.  Ej.  Exones) en donde pueda estar la mutación; una vez identificado el exón alterado, se procede a secuenciar el ADN para conocer la mutación:

Polimorfismo de Cadena Sencilla de ADN (SSCP) y Análisis de Hetero dúplices (HET). Se aísla ADN genómico y se amplifican regiones codificantes (exones) del gen utilizando Oligos iniciadores separados por regiones de 150 a 200 pares de bases. Con fragmentos de este tamaño es posible detectar cambios en la movilidad electroforética de cadenas de ADN sencillas disociadas o de hetero dúplex mutantes.

Prueba de la Proteína Truncada (PTT). Mutaciones que causan la lectura prematura de un codón de terminación en el ARN mensajero producen proteínas truncadas. Principalmente son mutaciones 1. Sin sentido, 2. Por cambios de fase (de lectura del Código Genético) y 3. Errores de empalme (procesamiento del ARNhn a ARNm). Éste es el método de elección para genes en donde prevalece la presencia de mutaciones truncantes, por ejemplo, BRCA1 para cáncer mamario, APC para cáncer de colon, Distrofina para distrofia muscular. Es más fácil a nivel de ADN que a nivel de ARNm, por el fenómeno de Decaimiento de ARNm sin sentido.

Micro arreglos de ADN.  Esta es una nueva tecnología emergente en la cual secuencias de oligonucleótidos son arregladas a alta densidad en renglones y columnas dentro del espacio de una laminilla de microscopía. La longitud puede ser desde menos de 10 nucleótidos hasta más de 100 y un espacio de unos pocos centímetros puede contener miles de secuencias diferentes que permiten analizar cientos de diferentes variaciones en la secuencia nucleotídica de un gene.  Esta tecnología se usa también para obtener perfiles de expresión genética.  Los genes que se expresan en un tejido están representados en su población de ARNm y este se puede extraer de tejidos tumorales para comparar los genes que aumentan o disminuyen en su expresión en comparación al tejido normal.

“Western blot” e inmunohistoquímica. Estos métodos permiten identificar directamente la expresión de la proteína.  En el “western” (inmunotransferencia) la proteína se identifica por su peso molecular mediante electroforesis y anticuerpos específicos. En la IHQ se utiliza el anticuerpo para detectar a la proteína en cortes histológicos que permiten su evaluación en cuanto a su estado de expresión y de localización tisular.

Técnica de Western Blot

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